【摘要 】 目的 观察芪丹益肾降糖胶囊对糖尿病肾病 (DN)大鼠肾脏糖基化终产物 (AGEs)表达的影响 ，探讨其作用机制。 方法 用单侧肾脏切除并腹腔注射链脲佐菌素制备 DN 大鼠模型，随机分为假手术组、模型组、芪丹益肾降糖胶囊组，给药 12 周后，检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿蛋白排泄率(UAE)，免疫组化方法测定肾组织 AGEs 的表达。 结果 与假手术组比较，模型组大鼠 FBG、BUN、SCr、UAE均显著增高，肾组织 AGEs 表达明显增强;经芪丹益肾降糖胶囊治疗 12 周后，BUN、SCr、UAE 均明显低于模型组，肾组织 AGEs 表达明显下调。 结论 芪丹益肾降糖胶囊对 DN 大鼠有一定的治疗作用，其可能机制是下调大鼠肾组织 AGEs 的表达。
【关键词】 糖尿病肾病 糖基化终产物 芪丹益肾降糖胶囊
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1004-745X(2012)10-1607-02
糖尿病肾病(DN)是糖尿病的微血管病变，是患者死亡的主要原因，是影响 DN 患者生存质量和病死率的重要因素。据统计，DN 占糖尿病患者病死率的 60%，晚期糖基化终产物(AGEs)在 DN 的发病中具有重要作用[1]。本研究旨在观察芪丹益肾降糖胶囊对 DN 大鼠生化指标和肾组织 AGEs 表达的影响， 探讨其治疗 DN 的可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物 Wistar 大鼠 40 只，雄性，清洁级，体质量 180~220 g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。合格证号：810147。
1.2 药物与试剂 芪丹益肾降糖胶囊由黄芪、熟地黄、山药、茯苓、丹参、川芎等药物组成，由石家庄平安医院制剂室提供，批号080809;链脲佐菌素 (STZ)，美国 Sigma 公司 ，批号 S0130;考马斯亮蓝 G250，美国 Sigma 公司，批号 8R278B27;血糖试纸，美国强生公司，批号 2860467;免疫组化用兔抗大鼠 AGEs 受体单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，批号 080628。
1.3 仪器 代谢笼 (苏州冯氏实验动物设备有限公司); 日立220A 紫外可见分光光度计(日立公司);OneTouchUltraⅡ稳豪型血糖仪 (美国强生公司);7170 全自动生化分析仪 (日本 Hi-tachi);滑走式切片机 (日本 Sakura);奥林巴斯 BX-51 显微镜 、奥林巴斯 DP70 图像采集系统(日本 Olympus)。
1.4 模型制备 参照文献[2]方法，30 只雄性 Wistar 大鼠适应性喂养 1 周，以 3.3 mL/kg 腹腔注射 10%水合氯醛麻醉，常规消毒，背部切口 1~1.5 cm，暴露右肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎右肾门血管，切除右肾，缝合切口，术后动物恢复 1 周后。 将 STZ溶于 0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液(pH4.4)中，避光条件下迅速配成浓度为 1%STZ 溶液。 大鼠禁食 12 h 后， 按 60 mg/kg 剂量予以STZ 腹腔注射 ;72 h 后尾静脉取血 ，测定空腹血糖 (FBG)，以高于 16.7 mmol/L 为造模成功。 假手术组麻醉后仅切开大鼠皮层、肌层，不切除肾脏，随后缝合，1 周后腹腔注射柠檬酸缓冲液。
1.5 分组与给药 取造模成功动物 20 只，随机分为模型组、芪丹益肾降糖胶囊组，每组 10 只。另取 10 只正常大鼠作为假手术组。芪丹益肾降糖胶囊组按 4 g 生药/(kg·d)给药，灌胃时配制成0.4 g/mL 的生理盐水混悬液(相当于临床成人剂量的 10 倍)。 假手术组和模型组大鼠给予每日等体积生理盐水灌胃。 连续给药12 周。
1.6 标本采集与检测 (1)生化指标：腹主动脉取血，离心取血清，用全自动血生化分析仪测定血清尿素(BUN)、肌酐(SCr);代谢笼留取 24 h 尿液，用考马斯亮蓝法检测尿蛋白浓度，计算尿蛋白排泄率(UAE)。 (2)组织病理学指标：肾组织用 10%中性甲醛溶液固定后，乙醇脱水，石蜡包埋，制成 3 μm 厚的组织切片，进行 PAS 染色，光镜下观察肾组织病理学变化。 (3)AGEs 在肾脏的表达：采用免疫组织化学染色法。组织经石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、乙醇水化;磷酸盐缓冲(PBS)液洗 5 min×3 次;3% H2O2室温孵育 2 h;PBS 液洗 5min×3 次;将切片置于抗原修复液中 98~99 ℃煮 20 min，室温冷却，用 1%小牛血清白蛋白(BSA)封闭 10~15 min;倾去血清，滴加一抗，4 ℃过夜;PBS 液洗 5 min×3 次;滴加生物素标记二抗工作液，37 ℃孵箱内置 1 h;PBS 液洗 5 min×3次;二氨基联苯胺(DAB)显色 10 min;流水终止反应 3 min;苏木素复染细胞核 3 min;流水洗 1 min;1%盐酸酒精分化;流水蓝化10 min;梯度酒精脱水 5 min;中性树脂封片。 实验中阳性对照组用已知阳性标本，用 PBS 代替一抗作阴性对照。 光镜下阳性反映部位为棕黄色，细胞核呈淡蓝色。 光镜下低倍视野(×100)观察反应情况， 每例分别随机选取 5 个高倍视野 (×400)， 运用HMIAS-2000 高清晰彩色病理图文报告分析系统测定阳性表达物的平均光密度(MOD)。
1.7 统计学处理 应用统计软件 SPSS13.0 进行统计学处理，计量资料以(x±s)表示，多组间比较用单因素方差分析，方差齐性采用 LSD 法进行组间两两比较。 P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 芪 丹 益 肾 降 糖 胶 囊 对 DN 大 鼠 生 化指 标 的 影响 见表 1。模型组大鼠 FBG 与假手术组比较，显著增高(P <0.01)，芪丹益·肾降糖胶囊组大鼠FBG 低于模型组， 但无统计学意义 (P >0.05)。 与假手术组比较 ，模型组大鼠 BUN、SCr、UAE 显著增高(P < 0.01)。芪丹益肾降糖胶囊组大鼠 BUN、SCr 则显著低于模型组(P<0.05 或 0.01)。
2.2 芪丹益肾降糖胶囊对DN大鼠肾脏病理的影响 假手术组肾小球、肾小管结构清晰，肾小球系膜区未见明显改变。 模型组大鼠肾脏明显增大，肾小球球囊部分黏连，囊腔增大，鲍曼氏囊囊壁增厚，肾小球内系膜细胞和系膜基质增生，呈弥漫性或团块状，基底膜增厚;肾小管上皮细胞空泡变性，部分肾小管扩张，部分管腔内可见蛋白管型，肾小管上皮细胞脱落;肾间质可见散在或成片淋巴细胞和单核细胞浸润。 芪丹益肾降糖胶囊组肾小球改变轻微，系膜轻度增生，少数肾小管轻度扩张，肾小管上皮细胞空泡变性较模型组明显减轻，少量炎性细胞浸润，偶见蛋白管型。
2.3 芪丹益肾降糖胶囊对 DN 大鼠肾脏 AGEs 表达的影响 见图 1，表 2。 免疫组化结果显示，AGEs 在假手术组肾小球及肾小管细胞有少量表达，模型组表达明显增强。 与模型组相比，芪丹益肾降糖胶囊组 AGEs 表达明显减弱(P<0.05)。
3 讨 论
DN 属中医学 “消渴 ”、“劳淋 ”、“水肿 ”等范畴 ，病机关键为肾元亏虚，毒损肾络，病性为本虚标实：气阴亏虚为本，病位在肾，连及于脾;痰湿、浊毒、瘀血等为标实之证，本病由于消渴病日久阴损及阳而出现气阴两虚、脾肾亏乏，脾虚运化失常，肾虚气化不利，水液代谢障碍停而为湿;气虚无力运血则血行不畅凝而为瘀，湿浊、瘀血相搏结，或可化热，日久而成痰瘀之毒、痹阻血脉、毒伤肾络、肾功失调，渐至糖尿病肾病[3]。 芪丹益肾降糖胶囊方中黄芪、熟地黄、山茱萸肉为君药，益气养阴，补肾填精，生津止渴;山药、茯苓益气健脾，利湿渗水，与黄芪为伍，可助脾输布津液以灌溉五脏;丹参、川芎、三棱、益母草等为佐药，既可活血祛瘀生新，又活血利水;小量附子为使药，意在“益火之源，以消阴翳”。 诸药合用共奏益气养阴、活血化瘀、益肾健脾之功效。研究发现，黄芪能调节 DN 鼠层粘连蛋白的表达，减少其血清内皮素含量，增加一氧化氮含量，对 DN 起到保护作用[4-5];丹参[6]、川芎嗪[7-8]能显著抑制 DN 炎性细胞因子的表达，保护肾脏功能。 笔者之前的研究[9]也已经证实了芪丹益肾降糖胶囊对 DN大鼠具有减少尿蛋白、改善肾脏病理等作用。
AGEs 是非酶糖化反应的终末期产物，生理状态下人体内存在少量的 AGEs， 随着年龄的增长含量有所增加，AGEs 与长寿命蛋白质变性和生物衰老有关。病理条件下，其产生增加或排泄减少，造成体内血浆中 AGEs 增加。 肾功能损伤导致 AGEs 排泄减少，引起血浆中 AGEs 浓度增加，同时积聚的 AGEs 又会加重对肾脏的破坏， 形成恶性循环。 AGEs 通过对细胞外基质的修饰、引起肾脏炎症损伤、增加肾脏氧化损伤、对肾脏细胞表型的影响等途径，促进 DN 的发生发展[10]。
本实验研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中 AGEs 表达明显增加，而经过芪丹益肾降糖胶囊干预后 AGEs表达明显减少。 因此，芪丹益肾降糖胶囊具有抑制 AGEs 在 DN大鼠肾脏表达的作用，这可能是其肾脏保护作用的机制之一，但其抑制 AGEs 表达的具体途径有待于进一步研究。
参 考 文 献
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